(1)镜检：先用小刀刮弃病甲表面疏松甲屑，再刮取甲屑于载坡片上，滴10%氢氧化钾后加盖玻片，在酒精灯上加热以溶解角质。显微镜下可见孢子和菌丝。
(2)培养：由于致病菌多样，所用培养基应注意多样化，应分别使用含和不含放线菌酮的沙堡弱培养基，以避免某此对放线菌酮敏感的菌被抑制而出现假阴性。若要分离马拉色菌则要用含菜子油或橄榄油的培养基，35-37℃条件下培养。分离出不常见菌不能立即断定为致病菌，但也不能轻易判断为污染菌，应重复取材多次培养，才能确定其在致病中的地位。
(3)组织病理学：是确定灰指甲诊断的另一种技术，尽量向近端多剪甲及甲下角化物，经脱钙、软化后切片，PAS或银染色。可见甲组织中发现大量孢子和菌丝断面，比培养发现真菌的阳性率高并有助于区别真菌是侵入甲还是仅仅定植在甲下脆屑。但因甲组织坚硬，处理操作过程较复杂，且有时在切片上难以确定是菌体或其他成分，需要一定经验。
(4)溶甲涂片：新近我们采用20%NaOH在56℃加热30分钟，将甲的角蛋白溶解，经离心、洗涤后取未被溶解的菌体成分涂片用Parker墨水染色，镜下口请晰地见到菌丝或孢子，不仅可大大提高阳性率，而且能完整地观察到菌体在甲内的形态特征，发现了白念珠菌的顶端厚壁抱子、丝状菌的关节孢子、曲菌的孢子头、青霉菌的帚状枝等结构，与纯培养标本涂片所见一致，丰富了对灰指甲的认识。
(5)电镜观察：包括扫描电镜和透射电镜，分别观察表面和内部结构，主要用于研究。
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